前言
聚∊-己内酯PCL、明胶GEL和纳米晶羟基磷灰石HAp通过一种新的制造方法制备了新型PCL-GEL-HAp纳米复合支架。
以寻找最佳的制备方法，通过不同的方法对溶剂进行测试，找到最佳的方法和溶剂，并通过层状溶剂浇铸结合冷冻干燥制备纳米复合材料。丙酮和蒸馏水分别用作PCL和GEL溶剂。
机械测试表明，通过支架增加PCL重量，由于极限应力、刚度和弹性模量的增加0%wtPCL为8MPa，50%wtPCL为23.5MPa，导致最终纳米复合材料力学行为得到改善。
重量PCL，体外的使用L929小鼠成纤维细胞系ATCC的支架的细胞毒性没有毒性迹象。结果表明，该支架具有骨组织工程应用的前提条件。
理论介绍
尽管多孔生物材料作为纳米复合支架的广泛应用，但成功集成支架的设计和优化仍是一门不精确的科学。在设计生物材料时必须考虑的标准包括：提供适当的机械性能、包括足够大的孔隙量以容纳和提供足以用于组织工程应用的细胞质量、适当的生物相容性和生物降解性。
通过选择合适的溶剂和制备方法，可以利用生物活性填料和合成聚合物与天然聚合物的共混制备各种纳米复合材料支架。
混合合成和天然聚合物的纳米复合支架可以利用两种聚合物的优势。在纳米复合材料中应用生物活性材料，尤其是HAP，可以极大地提高这些材料的骨再生能力。近年来，许多研究人员研究了由合成聚合物和天然聚合物共混而成的支架在组织再生中的应用潜力。
凝胶是一种天然的生物聚合物，由胶原酶控制水解而得。凝胶因其生物来源、生物降解性、生物相容性和成本相对较低的商业可用性等优点而被广泛应用于生物医学领域。
在医药和医学领域，凝胶一直被用作血管假体的密封剂，毒品运送者，伤口愈合用的绷带。不管怎样，将凝胶与合成聚合物混合的方法已被其他研究人员频繁采用。
在合成聚合物中，PCL被认为是与GEL混合的合适选择，因为PCL是一种半结晶线性可吸收脂肪族聚酯，并且由于其脂肪族酯键易于水解而容易发生水解降解。另一方面，由于可吸收缝合线、药物输送系统以及骨移植替代品，PCL被视为用于组织工程应用的软硬生物相容性材料。
从另一个角度来看，生物材料领域的研究重点是以磷酸钙为原料合成生物活性陶瓷，特别是在HAP的合成中[CA10保46OH2]三十年应用於骨科及牙科。但由于其脆性和塑性性较低，难以在缺陷现场进行处理和保存。每一种材料在组织工程支架中得到了广泛的应用，但它们都有它们的问题，为了改进这些弱点，许多工作已经完成。
在另一部作品中电子书中，凝胶纳米复合材料被制成泡沫。泡沫的力学性能和LIA的同一研究电子书对GEL-磷灰石纳米纤维的生物和机械性能进行了检测，结果优于单独使用GEL，并且支架还表现出优异的生物相容性和机械稳定性。
材料和方法
纳米晶羟基磷灰石HAP粉末的合成，通过反应物的水溶液通过化学沉淀制备HAP粉末。制备了0.09米磷酸二铵溶液和0.15%米硝酸钙四水溶液，加入少量氢氧化钠溶液，使两种溶液的PH值达到10。
磷酸盐溶液被加入硝酸钙溶液中，导致HAP的沉淀。在室温条件下，在一定时间24小时内成熟后，用离心机回收沉淀物，然后用去离子水清洗。重复了五轮洗涤和离心，以确保完全去除副产品。
合成粉末在空气中用3加热速率在800℃时进行了1小时的煅烧。将样品在冷冻干燥机中干燥10小时后，在管式电炉中以0°C/min从室温升至800°C。纳米复合材料支架的制作方法，由于GEL分子的疏水结构和PCL分子的亲水结构，将这两种聚合物作为纳米复合材料应用非常具有挑战性。
找到最佳制备方法后，将10%w/v的GEL添加到蒸馏水中并在40℃下搅拌1小时。HAp纳米颗粒以凝胶的40wt%添加到溶液中。将混合物在40°C下通过搅拌器超声均化1小时。将GEL-HAp溶液倒入塑料皿中并在环境条件下放置10分钟以形成第一层GEL-HAp层。
然后，将10%w/vPCL的丙酮溶液倒在GEL-HAp层上，并将复合物在环境条件下放置20分钟以形成PCL层。丙酮蒸发后，再次倒入GEL-HAp溶液以制备下一个GEL-HAp层。继续层压以形成第四GEL-HAp层。
丙酮蒸发后，在PCL层的表面观察到大量的宏观孔隙，这使得GEL能够影响整个纳米复合材料层。制备了五个样品，其中PCL的量分别为GEL的0、20、30、40和50wt%。
将样品在-20℃冰箱中冷冻24小时，然后移至冷冻干燥机中72小时。将制备好的样品浸入1%GA水溶液中24小时以使GEL-HAp层交联。最后，将交联的纳米复合材料仔细洗涤几次以除去剩余的GA，然后在冷冻干燥机中干燥。
将制备好的样品浸入1%GA水溶液中24小时以使GEL-HAp层交联。最后，将交联的纳米复合材料仔细洗涤几次以除去剩余的GA，然后在冷冻干燥机中干燥。
SBF溶液的制备，SBF溶液通过将试剂级NaCl、KCl、NaHCO3、MgCl2.6H2O、CaCl2和KH2PO4溶解到蒸馏水中来制备，并用TRIS三羟甲基氨基甲烷和1NHCl缓冲至pH=7.25。37°C。其成分，并与人血浆进行了比较。
使用Siemens-BruckerD5000衍射仪通过X射线衍射XRD分析所得HAp粉末。该仪器的工作电压和电流设置分别为40kV和40mA，并使用Cu-Kα辐射1.540600。为了进行定性分析，以2°/min的扫描速度，步长0.02°，步长时间1s，在20≤2θ≤60°的间隔内记录XRD。
用透射电镜透射电镜，CMM200-飞利浦对HAP粒子进行了表征。为此目的，将颗粒沉积在支持碳膜的铜网格上。这些微粒通过丙酮或乙醇中的稀释悬浮物沉积到支架网上。用衍射幅值对比和高分辨率相位对比度成像对颗粒形状和尺寸进行了表征。
为了计算沉淀粉中钙/磷的摩尔比，分别采用数字化学分析法，通过电子数据分析法和原子吸收光谱法AAS对沉淀粉中钙和磷的含量进行了化学分析。
用傅立叶变换红外光谱法测定了纳米复合样品的官能团。为了进行红外光谱分析，首先对样品进行粉末处理，然后将其分散到Kbrr红外级颗粒中，然后在400-4000cm-1光谱仪上记录的光谱，扫描速度为23扫描/分钟，分辨率为4厘米-1。
对多孔泡沫进行压缩强度测试。每个样品均使用Zwick-RoellMCT-25-400，德国在环境条件下以2mm/min的十字头速度和500N电池负载加载。获得应力-应变曲线以确定机械性能，包括弹性模量、压缩强度、最大应力和最大应力应变。弹性模量是从加载初始阶段2%应变的斜率获得的。每种纳米复合材料测试了五个样本。
生物矿化
为了研究所制造的支架的类骨磷灰石形成能力，将三个相同重量和形状的支架浸入SBF溶液中，并在封闭的Falcon管中于37℃下孵育3、7和14天。在指定的时间后，移除支架，然后用去离子水仔细清洗四次以去除吸附的矿物质。
最后将支架冻干，使用SEM和EDX观察和分析矿化情况。用L929小鼠成纤维细胞系ATCC进行细胞毒性研究。细胞在富含最小必需培养基的聚苯乙烯板中播种，再配以10%的胎儿牛血清、100单位/毫升的盘尼西林和100克/毫升链霉素，然后在潮湿的空气中孵化37℃和5%CO2。
当细胞达到一致时，将经过消毒的支架置于与细胞直接接触的位置，在相同条件下孵化48小时。采用负超高分子量聚乙烯和正铜对照。48小时后，在光学显微镜下观察细胞.根据ISO10993-5的规定，细胞反应分为0、1、2和3。所有实验都在第五次复制中进行。
该方法是有效的。统计分析采用单因素变异分析和P<0.05有意义的TUKY试验。还采用了科莫戈罗夫-斯米诺夫试验，进行了群体正常化调查。
纳米晶HAP粉末的XRD数据。Fig.1a。用X射线衍射仪进行了XRD分析。衍射图的直线基线和尖峰证实了该产物结晶良好。XRD模式表明，HAP是在这个样品中形成的，而该技术没有检测到其他磷酸钙杂质的痕迹。
烧结样品的XRD模式可以在标准卡中与HAP完全索引JCPDS编号。发现的唯一阶段。在材料中没有发现加工残留物或次生相。采用透射电镜分析法对HAP微晶进行了检测和评价。HAP粉末的电镜显微图显示在Fig.1二。HAp颗粒的晶体结构呈椭圆形，晶粒尺寸在8-12nm范围内。
通过EDTA滴定技术和AAS进行定量化学分析，对元素组成Ca和P含量和Ca/P摩尔比的测量结果进行化学分析。
Ca和P含量以及体积Ca/P摩尔比分别确定为38.63wt%、17.48wt%和1.71。该合成粉末的测得Ca/P比高于纯HAp相预期的化学计量比1.667，纯HAp相可能是由于局部存在碳酸盐磷灰石而产生的，其中Ca/P摩尔比可高达3.33。
纳米复合支架
显示PCL、GEL和纳米复合材料层不同方面的形貌。GEL层的形态分析显示孔分布均匀，平均尺寸约为150μm。还可以看出，孔要么是互连的，要么是通过薄壁分隔开的。在制造过程中，预计HAp纳米颗粒均匀分布在整个GEL网络中。
甚至在pcl层中也可看到多孔结构，特别是在远离gel-pcl边界的地区。pcl层的孔隙结构较为复杂，孔隙尺寸较小，约为50倍。值得注意的是，在大多数区域，pcl和凝胶层都是机械结合在一起形成凝胶-pcl边界的。
Fig.2c和d。正如前面提到的，在层压技术中丙酮的蒸发，让PCL层的宏观点使凝胶层在整个纳米复合支架中的连续性成为可能。
为了研究纳米复合支架中的化学键，研究了从两个样品中获得的红外光谱结果。显示了样品的红外光谱，样品的温度为20%，温度为50%，给出了由于出现峰值而检测到的化学键的信息。
实验结果表明，20%重的聚氯乙烯的红外光谱与50%重的聚氯乙烯的红外光谱基本一致。有三个系列的峰，与HAP化学结构相关，以及对两个支架样本包括2930，2870，1670，1293和1240cm所观察到的与PLC相关的拉伸模式的红外光谱。
但在1345和2363cm1处有两个与GEL-HAp混合后组分交联后形成的化学键有关的峰。第一个表明GEL的羧基和HAp的Ca+2离子之间形成化学键，这在以前的研究中也提到过。在此，HAP纳米颗粒和凝胶在纳米复合材料中的化学结合有三个主要步骤。
值得注意的是，根据敏芳的说法电子书，有两个主要的稳定来源可以防止HAp颗粒团聚的发生。第一个是静电稳定，另一个是空间稳定。GEL-HAp溶液中的静电稳定主要是由于HAp纳米粒子表面吸附了Ca2+离子，吸附会产生双电层。
根据PCL和GEL链可以通过化学键合。在此，值得一提的是，纳米复合材料支架的FTIR光谱中酰胺基的出现的箭头所示，表明PCL链与GEL侧壁化学键合，导致官能团的引入。所有这些化学键之间的制造脚手架的元素，可以导致一个强大和有效的结构的脚手架。
由于结构需要承受体外培养和体内植入过程中的应力，因此制造的多孔支架的机械性能在许多组织工程应用中受到特别关注。机械特性也会影响工程组织内的特定细胞功能。这就是在本研究中检查支架的压缩特性的原因。
研究所制造的纳米复合材料支架在L929细胞作用48小时后没有显示出任何毒性迹象。细胞呈纺锤形并形成单层。细胞毒性等级测量为零，这对应于非细胞毒性。
结论
在测试了不同的溶剂和制造方法后，采用新的有效层压技术成功制造了新型PCL-GEL-HAp纳米复合材料支架。GEL和HAp、GEL和GA以及GEL和PCL之间的化学键使支架具有有效的机械性能。纳米复合支架本质上是大孔的。
浸泡在SBF中后，支架表面和孔隙上逐渐形成骨状磷灰石层。细胞毒性评价结果表明支架具有生物相容性。PCL-GEL-HAp纳米复合支架可以作为骨组织工程应用的适当替代品。
参考文献
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